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科学前沿丨高保真DNA聚合酶的魔力是什么?

背景

Taq 聚合酶在 PCR 方面是久经考验的真正标准,但这并不意味着它是高灵敏度应用中最准确的聚合酶。 相反,由于结合了更严格的碱基读取和校对活动,称为高保真聚合酶的替代酶在 PCR 生成的扩增子中提供更高的准确性1.

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高保真聚合酶的发现和开发一直是人们关注的焦点。华信生物科技有限公司很多年了。 对于实验结果的成败主要取决于DNA序列是否正确的实验,DNA扩增准确度高的高保真PCR酶在实验(如克隆、突变分析和测序)中起着至关重要的作用。

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图 1:克隆、突变分析和测序

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什么是高保真 DNA 聚合酶?

高保真 DNA 聚合酶包含聚合酶结构域和外切核酸酶结构域2. 聚合域具有5'-3'聚合酶活性,负责聚合; 酶切割结构域具有 3'-5' 外切核酸酶活性(也称为校对活性),负责切除未配对的核苷酸。

在PCR扩增过程中,当引物与模板完全互补时,进入聚合域。 在聚合酶活性的作用下,游离的脱氧核苷酸通过互补配对的原理依次与引物的3′端结合,新的DNA链从5′端向3′端延伸(图1-a)。 当引物末端结合的核苷酸未与模板配对时,错配的核苷酸会引起结构扰动(图 1-b)。 新的 DNA 链不能继续向前延伸,然后进入核酸外切酶结构域。 在外切酶活性的作用下,错配的核苷酸被切除(图 1-c)。 切除后,核苷酸会正确重组,新的DNA链可以继续从5'延伸到3'(图1-d)。 最终,可以精确复制新的 DNA 链。

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图2:高保真DNA聚合酶工作原理示意图

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DNA聚合酶的保真度是多少?

DNA 聚合酶的保真度是指其准确复制模板的能力3. 具体来说,这涉及多个步骤:DNA 聚合酶能够读取模板链,选择合适的三磷酸核苷并在 3' 引物末端插入正确的核苷酸,保持标准的 Watson-Crick 碱基对4. 错误掺入率(错误核苷酸的掺入)称为聚合酶的“错误率”5. 除了有效区分正确和不正确的核苷酸掺入外,一些 DNA 聚合酶还具有 3'-5' 外切核酸酶活性。 此活动也称为“校对”,用于切除错误掺入的单核苷酸,然后用正确的核苷酸替换它们。 总体而言,高保真 PCR 能够利用高保真 DNA 聚合酶,将低错误掺入率与校对活性相结合,以实现目标 DNA 的可靠复制。

高保真DNA聚合酶的应用方向

基因功能研究

案例1:研究表明A基因可能参与拟南芥花青素的代谢。 为了验证这一假设,首先从拟南芥中扩增出A基因,然后将其构建到过表达或抑制表达载体中。 随后,通过农杆菌介导的方法将其转化到拟南芥中,使A基因在拟南芥中过度表达或抑制。 最后,利用形态学指标、生理指标和基因表达水平来判断这一假设是否成立。 

基因测序

案例2:为了探究拟南芥B蛋白家族不同基因的异同,需要将拟南芥B蛋白家族的所有基因进行扩增。 然后,获得了这些基因的碱基序列。 最后通过生物信息学分析对它们的异同进行了初步分析。

以上案例只是相关研究的冰山一角,但都需要利用PCR技术从实验中准确扩增出目标基因。 如果扩增的基因序列发生突变,后续分析将不准确。 因此,为了保证目标基因的准确扩增,在PCR扩增过程中需要使用高保真DNA聚合酶。

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图 3:全基因组关联研究的功能研究6 

剧场问答

Q1:高保真DNA聚合酶的扩增产物是平端的。 后续TA克隆如何在产品末尾加A?

A1:反应系统:10 µl / 反应程序:72°C,10 分钟

① 仅酶:1 µl 10×Taq Buffer (MgCl2Plus)、0.5 µl dNTP Mix (10 mM)、0.2 µl Taq DNA 聚合酶、1-7 µl 纯化 PCR 片段、ddH2O 补充到 10 µl。

② Mix:5 μl 2×Taq Master Mix,1-5 μl 纯化 PCR 片段,ddH2O 补充到 10 μl。

Q2:高保真酶DNA聚合酶扩增的片段是否保证不发生突变?

A2:高保真 DNA 聚合酶具有 3'-5' 外切酶活性,可降低 PCR 扩增过程中核苷酸错配的概率。 DNA聚合酶的保真度越高,核苷酸错配的概率越低,但这并不意味着在扩增过程中永远不会发生核苷酸错配。 因此,为了提高实验的成功率,建议从同一样本中挑选多个(>3)个单克隆进行测序。

Q3:不同公司的高保真DNA聚合酶保真度有可比性吗?

A3:高保真酶的保真度通常表示为Taq酶的几十倍。 常见的保真度测定方法包括蓝白筛选测定和下一代测序。 不同品牌的 DNA 聚合酶有不同的方法来确定保真度。 为了比较不同品牌 DNA 聚合酶的保真度,必须使用相同的保真度测定进行平行比较。

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参考

1.克洛伊。 (2018 年 12 月 12 日)。 高保真 DNA 聚合酶和何时使用它们。 克伦特生命科学。https://www.clentlifescience.co.uk/high-fidelity-dna-polymerases-and-when-to-use-them/

2. Kim, SW, Kim, DU, Kim, JK, Kang, LW, & Cho, HS (2008)。 Pfu 的晶体结构,来自激烈火球菌的高保真 DNA 聚合酶。国际生物大分子杂志42(4), 356-361。

3. Echols, H., & Goodman, MF (1991)。 DNA复制中的保真机制。生物化学年度回顾60(1), 477-511。

4. Kool, ET, Morales, JC, & Guckian, KM (2000)。 模拟 DNA 的结构和功能:洞察 DNA 稳定性和复制。Angewandte Chemie 国际版39(6), 990-1009。

5. Hestand, MS, Van Houdt, J., Cristofoli, F., & Vermeesch, JR (2016)。 通过单分子测序鉴定的聚合酶特异性错误率和谱。突变研究/突变的基本和分子机制784, 39-45。

6. Lichou, F. 和 Trynka, G. (2020)。 GWAS 变体的功能研究正在获得动力。自然通讯11(1), 1-4。

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