• วัน::

วิทยาศาสตร์ในห้องทดลอง |แก้ไขปัญหาค่า Ct สูง: การเพิ่มประสิทธิภาพ qPCR ในสามขั้นตอน

คุณกำลังมีปัญหากับ C สูงหรือไม่?tค่านิยมและการทำซ้ำได้ไม่ดี?

ค้นหาว่าปัญหามีสาเหตุมาจากการแสดงออกของยีนต่ำหรือไม่ และดูเคล็ดลับในการเพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบของคุณเพื่อแก้ไขปัญหาเหล่านี้

 

ยีนที่มีการแสดงออกต่ำคืออะไร?

ยีนที่มีการแสดงออกต่ำมักจะหมายถึงยีนที่มีการอ่านต่ำต่อกิโลเบสของ exon ต่อล้านแมปการอ่าน (RPKM) ในตัวอย่างที่กำหนดในการสอบวิเคราะห์ qPCR ค่า Ctค่าของยีนที่มีการแสดงออกต่ำมักจะสูงเกินไป บางครั้งมาพร้อมกับความสามารถในการทำซ้ำระหว่างหลุมที่ซ้ำกันไม่ดี ด้วยค่า C สูงt ค่ายีนอ้างอิงในระบบแสดงค่า C ปกติt ค่าในขณะที่ยีนเป้าหมายมี Ctค่านิยมสูงกว่า 30 (qPCR ที่มีสีย้อมเป็นหลัก)

 

1

รูปที่ 1 ภาพประกอบของยีนที่มีการแสดงออกต่ำ

 

เราจะเพิ่มประสิทธิภาพการตรวจ qPCR เพื่อการตรวจจับยีนที่มีการแสดงออกต่ำได้ดีขึ้นได้อย่างไร

01 โปรแกรม qPCR

 

ใช้โปรแกรมสามขั้นตอนแทนโปรแกรมสองขั้นตอนหรือเพิ่มเวลาขยายเพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการขยายเสียง

2

 

 

 

 

 

 

 

โปรแกรมสองขั้นตอน-ขยายเวลาขยาย-โปรแกรมสามขั้นตอน-ขยายเวลาขยาย

02 ขั้นตอนการทดลอง

A. เพิ่มจำนวนหลุมจำลองและกำจัดค่าผิดปกติ

B. เพิ่มตัวพา DNA หรือ RNA ที่ไม่ทำปฏิกิริยากับยีนเป้าหมายหรือขัดขวางการทดสอบ เพื่อลดการสูญเสียยีนเป้าหมายเนื่องจากการเกาะติดกับปิเปตทิปหรือผนังท่อระหว่างการจัดการของเหลว

03 ระบบปฏิกิริยา

ก. แม่แบบ: เทมเพลตมีความบริสุทธิ์ต่ำ มีสารยับยั้งรวมอยู่ด้วย การสลายตัวของเทมเพลต และอินพุตต่ำจะทำให้ค่า CT สูง

คำแนะนำ:

ü RNA: ประเมินความสมบูรณ์ของ RNA ด้วย agarose gel electrophoresis และความบริสุทธิ์ด้วย NanoDrop

ü การถอดเสียงแบบย้อนกลับ: เพิ่มจำนวนอินพุตเทมเพลต RNA

ü cDNA: เพิ่มอินพุต cDNA หรือใช้ปัจจัยการเจือจาง cDNA ที่ต่ำกว่า (ตามทฤษฎีแล้ว การเจือจาง 10 เท่าแต่ละครั้งจะเพิ่ม Ctมูลค่า 3.3)เมื่อใช้สารละลายสต็อก cDNA สำหรับ qPCR ปริมาณอินพุตไม่ควรเกิน 1/10 ของระบบปฏิกิริยา

 

บี ไพรเมอร์: การขยายแบบไม่เฉพาะเจาะจงใช้ไพรเมอร์และแท็คDNA polymerase ช่วยลดโอกาสที่ไพรเมอร์จะจับกับยีนเป้าหมายและลดประสิทธิภาพในการขยายสัญญาณ

คำแนะนำ: ปฏิบัติตามหลักการออกแบบไพรเมอร์เพื่อป้องกันการขยายเสียงที่ไม่เฉพาะเจาะจงประสิทธิภาพของสีรองพื้นควรอยู่ระหว่าง 90% – 110%

การคำนวณประสิทธิภาพของไพรเมอร์

ยีนเป้าหมายถูกเจือจางในการไล่ระดับสีที่แตกต่างกัน (อย่างน้อยสามครั้งการเจือจาง) และใช้เป็นเทมเพลตสำหรับ qPCRรับเส้นโค้งมาตรฐานปรับพอดีอัตโนมัติจากระบบ qPCR หรือนำเข้า Ctค่าลงใน Excel และลงจุดเส้นโค้งมาตรฐานด้วยตนเองแทนความชันของเส้นโค้งมาตรฐานเข้ากับสูตรประสิทธิภาพไพรเมอร์:

3

C. ชุดอุปกรณ์: การสร้างสูตร Taq DNA polymerase, บัฟเฟอร์, Mg2+และสีย้อมฟลูออเรสเซนต์จะแตกต่างกันไปตามชุด qPCR ที่แตกต่างกัน ซึ่งส่งผลต่อความจำเพาะ ความไว และประสิทธิภาพการขยายสัญญาณ

คำแนะนำ: ใช้ชุดอุปกรณ์ที่ออกแบบมาเป็นพิเศษสำหรับการตรวจหายีนที่มีการแสดงออกต่ำTaq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme #Q712) ของ Vazyme เหมาะอย่างยิ่งสำหรับความต้องการในการทดสอบยีนที่มีการแสดงออกต่ำ

 

[Vazyme #Q712: การตรวจจับที่แข็งแกร่งของระบบการแสดงออกต่ำ] การแสดงประสิทธิภาพ

การตรวจหาเทมเพลตที่มีสำเนาน้อยมีความละเอียดอ่อนมากขึ้น

การทดสอบการเจือจางต่อเนื่อง 10 เท่าของเทมเพลตพลาสมิดของมัยโคพลาสมา 6 ครั้ง แสดงให้เห็นว่า Vazyme #Q712 แสดงกราฟการขยายและความเชิงเส้นที่ยอดเยี่ยมสำหรับพลาสมิดที่มีสำเนาต่ำ และสามารถตรวจจับพลาสมิดได้ต่ำถึง 1.75 สำเนา (การเจือจาง 0.35 สำเนา /μl, 5 ไมโครลิตรอินพุต)เมื่อเปรียบเทียบกับชุด qPCR ที่ใช้สีย้อมรุ่นก่อนหน้าของเรา Vazyme #Q712 มี C ต่ำกว่าtค่าที่ขีดจำกัดการตรวจจับ (LOD) ของการเจือจางครั้งที่หก (ความเข้มข้นต่ำสุด) ซึ่งบ่งชี้ถึงความไวที่สูงขึ้น

企业微信截图_9833087a-0607-4d4a-87ae-8d2d1d47ee1f

รูปที่ 2 เส้นโค้งการขยายที่หมายเลขสำเนาต่างกัน (Vazyme #Q712 เทียบกับชุดก่อนหน้าของ Vazyme)

Ct ค่า

คัดลอกหมายเลข (สำเนา/ไมโครลิตร)

ชุดก่อนหน้าของ Vazyme

Q712

3.5 × 104

17.56

16.72

3.5 × 103

20.87

19.95

3.5 × 102

24.05

23.04

3.5 × 10

27.21

26.57

3.5

30.92

29.77

0.35

34.66

32.71

ประสิทธิภาพการขยายสัญญาณ

97%

104%

รูปที่ 3 คt ค่าที่หมายเลขสำเนาต่างกัน (Vazyme #Q712 เทียบกับชุดก่อนหน้าของ Vazyme)

 

การตรวจจับเทมเพลตที่มีสำเนาน้อยมีประสิทธิภาพมากขึ้น

อัตราการตรวจจับชิ้นส่วนเป้าหมายที่มีสำเนาเดียวควรเป็นไปตามสถิติปัวซองตามทฤษฎีแล้ว 70% ของเทมเพลต 1.75-copy คาดว่าจะทดสอบเป็นบวก และ 30% คาดว่าจะทดสอบเป็นลบเทมเพลตพลาสมิดของมัยโคพลาสมาที่มีสำเนาต่ำ (1.75 สำเนา) ได้รับการประเมินโดยใช้ Vazyme #Q712 และผลิตภัณฑ์ที่เทียบเคียงได้ของซัพพลายเออร์ Aผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าชุดอุปกรณ์ทั้งสองให้อัตราการตรวจจับที่คาดการณ์โดยการแจกแจงปัวซองวาไซม์ #Q712มีอัตราการตรวจจับ 75%ดีกว่าสินค้าของ Supplier A

6

รูปที่ 4 การตรวจหาพลาสมิดที่มีสำเนา 1.75 (Vazyme #Q712 เทียบกับซัพพลายเออร์ A)

 

ข้อมูลการสั่งซื้อ

การทดสอบระบบที่มีการแสดงออกต่ำอย่างง่ายดายด้วยกราฟการขยายสัญญาณที่ยอดเยี่ยม!

ชื่อผลิตภัณฑ์

แมว.เลขที่

ขนาด

Taq Pro Universal SYBR qPCR มาสเตอร์มิกซ์

Q712-02

500 rxns (20 ไมโครลิตร/rxn)

 

 

วัสดุสิ้นเปลืองที่แนะนำ

ใช้ร่วมกับวาไซม์วัสดุสิ้นเปลืองเพื่อให้ได้ข้อมูลที่เชื่อถือได้มากขึ้น

 

ชื่อผลิตภัณฑ์

แมว.เลขที่

ขนาด

แถบ PCR 8 หลอด

PCR Strips 0.1 มล. 8 หลอด (พร้อมฝาปิด)

PCR00801-EN

125 แผ่น

PCR Strips 0.2 มล. 8 หลอด (พร้อมฝาปิด)

PCR00802-EN

125 แผ่น

จาน 96 หลุม

แผ่น PCR แบบกึ่งกระโปรง 96 หลุม 0.1 มล

PCR09601SS

20/กล่อง

แผ่น PCR แบบกึ่งกระโปรง 96 หลุม 0.2 มล

PCR09602SS

20/กล่อง

ซีลฟลิมส์

ฟิล์มปิดผนึกเพลทที่กระตุ้นด้วยแรงดัน

PCR09600PF

100/กล่อง

ฟิล์มซีลเพลทแบบมีกาวในตัว

PCR09600SF

100/กล่อง

           

 

เรียนรู้ข้อมูลเพิ่มเติมหรือสั่งซื้อออนไลน์ โปรดไปที่: www.vazyme.com