• օր::

Գիտությունը լաբորատորիայում |Բարձր Ct արժեքների վերացում. qPCR օպտիմիզացում երեք քայլով

Դուք խնդիրներ ունեք բարձր C-ի հետtարժեքներ և վատ կրկնելիություն:

Պարզեք, թե արդյոք խնդիրները պայմանավորված են ցածր գենային արտահայտությամբ, և ստուգեք խորհուրդներ, թե ինչպես օպտիմալացնել ձեր փորձը այս խնդիրները լուծելու համար:

 

Ի՞նչ է ցածր արտահայտված գենը:

Ցածր արտահայտված գենը սովորաբար վերաբերում է այն գեներին, որոնք ունեն ցածր ընթերցումներ մեկ էկզոնի կիլոբազայի մեկ միլիոն քարտեզագրված ընթերցման համար (RPKM) տվյալ նմուշում:qPCR վերլուծություններում CtՑածր արտահայտված գեների արժեքները հաճախ չափազանց բարձր են, երբեմն ուղեկցվում են կրկնվող հորերի միջև վատ վերարտադրելիությամբ: Բարձր C-ովt արժեքները, տեղեկատու գեները համակարգում ցուցադրում են նորմալ Ct արժեքներ, մինչդեռ թիրախ գեներն ունեն Ctարժեքներ30-ից բարձր (ներկի վրա հիմնված qPCR):

 

1

Նկար 1. Ցածր արտահայտված գեների նկարազարդում

 

Ինչպե՞ս կարող ենք օպտիմիզացնել qPCR վերլուծությունները՝ ցածր արտահայտված գեների ավելի լավ հայտնաբերման համար:

01 qPCR ծրագիր

 

Երկքայլ ծրագրի փոխարեն օգտագործեք երեք քայլ կամ ավելացրեք երկարացման ժամանակը ուժեղացման արդյունավետությունը բարելավելու համար:

2

 

 

 

 

 

 

 

Երկքայլ ծրագիր - Ընդլայնված երկարաձգման ժամանակ - Երեք քայլ ծրագիր - Երկարաձգված երկարաձգման ժամանակ

02 Փորձարարական ընթացակարգ

Ա. Մեծացնել կրկնվող հորերի քանակը և հեռացնել ծայրամասերը.

B. Ավելացրե՛ք կրիչ ԴՆԹ կամ ՌՆԹ, որոնք չեն արձագանքում թիրախային գենին և չեն խանգարում վերլուծությանը, որպեսզի նվազագույնի հասցնեն թիրախային գեների կորուստը՝ կապված հեղուկի հետ աշխատելու ժամանակ խողովակների ծայրերին կամ խողովակների պատերին կպչուն լինելու պատճառով:

03 Ռեակցիայի համակարգ

A. Կաղապար: Կաղապարի վատ մաքրությունը, ներառված արգելակիչները, կաղապարի քայքայումը և ցածր մուտքագրումը կհանգեցնեն բարձր CT արժեքների:

Առաջարկություն:

ü ՌՆԹ. Գնահատեք ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզով և մաքրությունը NanoDrop-ով;

ü Հակադարձ արտագրում. Բարձրացնել ՌՆԹ-ի կաղապարի մուտքագրման քանակը;

ü cDNA. Բարձրացրեք cDNA մուտքագրումը կամ օգտագործեք cDNA-ի նոսրացման ավելի ցածր գործակից (տեսականորեն յուրաքանչյուր 10 անգամ նոսրացում ավելացնում է C-ըtարժեքը 3.3-ով):qPCR-ի համար cDNA պահեստային լուծույթ օգտագործելիս մուտքային քանակությունը չպետք է գերազանցի ռեակցիայի համակարգի 1/10-ը:

 

B. Primer: Ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացումը սպառում է պրայմերներ ևԹաքԴՆԹ պոլիմերազա, նվազեցնելով պրայմերների միացման հնարավորությունը թիրախ գեներին և վտանգելով ուժեղացման արդյունավետությունը:

Հանձնարարական: Հետևեք այբբենարանի նախագծման սկզբունքներին` կանխելու ոչ հատուկ ուժեղացում:Այբբենարանի արդյունավետությունը պետք է լինի 90%-110% միջակայքում:

Այբբենարանի արդյունավետության հաշվարկ

Թիրախային գենը նոսրացվում է տարբեր գրադիենտներով (առնվազն երեք նոսրացումներով) և օգտագործվում է որպես qPCR-ի ձևանմուշ:Ստացեք ավտոմատ հարմարեցման ստանդարտ կորեր qPCR համակարգից կամ ներմուծեք Ctարժեքները Excel-ում և ձեռքով գծագրեք ստանդարտ կորերը:Միացրեք ստանդարտ կորի թեքությունը այբբենարանի արդյունավետության բանաձևի մեջ.

3

C. Կոմպլեկտներ: Taq ԴՆԹ պոլիմերազի, բուֆերների, մգ2+, և լյումինեսցենտային ներկերը տարբեր են տարբեր qPCR հավաքածուներում՝ ազդելով յուրահատկության, զգայունության և ուժեղացման արդյունավետության վրա:

Առաջարկություն: Օգտագործեք փաթեթներ, որոնք հատուկ նախագծված են ցածր արտահայտված գեների հայտնաբերման համար:Vazyme's Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme #Q712) իդեալական է ձեր ցածր արտահայտված գեների փորձարկման կարիքների համար:

 

[Vazyme #Q712. Ցածր արտահայտման համակարգերի կայուն հայտնաբերում] Performance Showcase

Ցածր պատճենման կաղապարների ավելի զգայուն հայտնաբերում

Միկոպլազմայի պլազմիդի ձևանմուշի վեց 10 անգամ սերիական նոսրացումների վերլուծությունները ցույց են տալիս, որ Vazyme #Q712-ը ցուցադրում է գերազանց ուժեղացման կորեր և գծայնություն ցածր կրկնօրինակման պլազմիդների համար և ունակ է հայտնաբերել պլազմիդների մինչև 1,75 օրինակ (0,35 օրինակ /5 μl նոսրացում, μl մուտքագրում):Համեմատած մեր ներկերի վրա հիմնված qPCR հավաքածուի ավելի վաղ տարբերակի հետ՝ Vazyme #Q712-ն ունի ավելի ցածր Ctարժեքը վեցերորդ նոսրացման հայտնաբերման սահմանին (LOD) (նվազագույն կոնցենտրացիան), որը ցույց է տալիս ավելի բարձր զգայունություն:

企业微信截图_9833087a-0607-4d4a-87ae-8d2d1d47ee1f

Նկար 2. Ուժեղացման կորեր տարբեր պատճենների համարներով (Vazyme #Q712 ընդդեմ Vazyme-ի նախորդ հավաքածուի)

Ct Արժեք

Պատճենահանման համարը (պատճեններ / μl)

Vazyme-ի նախորդ հավաքածուն

Q712

3,5 × 104

17.56

16.72

3,5 × 103

20.87

19.95

3,5 × 102

24.05

23.04

3,5 × 10

27.21

26.57

3.5

30.92

29.77

0,35

34.66

32.71

Ուժեղացման արդյունավետություն

97%

104%

Նկար 3. Գt Արժեքները տարբեր պատճենների համարներով (Vazyme #Q712 ընդդեմ Vazyme-ի նախորդ հավաքածուի)

 

Ցածր պատճենման ձևանմուշների ավելի ուժեղ հայտնաբերում

Մեկ օրինակով թիրախային բեկորների հայտնաբերման արագությունը պետք է համապատասխանի Պուասոնի վիճակագրությանը:Տեսականորեն ակնկալվում է, որ 1,75 օրինակով ձևանմուշների 70%-ի թեստը դրական է, իսկ 30%-ը բացասական է:Ցածր պատճենով (1,75 օրինակ) միկոպլազմայի պլազմիդի ձևանմուշները փորձարկվել են՝ օգտագործելով Vazyme #Q712 և մատակարար Ա-ի համադրելի արտադրանքը:Արդյունքները ցույց են տալիս, որ երկու փաթեթներն էլ տալիս են հայտնաբերման արագությունը, որը կանխատեսվում է Պուասոնի բաշխմամբ:Վազիմ #Q712ունի հայտնաբերման մակարդակը 75%, ավելի լավ, քան մատակարար Ա-ի արտադրանքը:

6

Նկար 4. 1.75-պատճենով պլազմիդների հայտնաբերում (Vazyme #Q712 ընդդեմ մատակարար A-ի)

 

Պատվերների մասին տեղեկություններ

Ցածր արտահայտման համակարգերի հեշտ փորձարկում՝ ուժեղացման հոյակապ կորերով:

ապրանքային անուն

Կատու.Ոչ

Չափը

Taq Pro ունիվերսալ SYBR qPCR Master Mix

Q712-02

500 rxns (20 μl/rxn)

 

 

Առաջարկվող սպառվող նյութեր

Օգտագործեք Vazyme-ի հետ միասինսպառվող նյութերավելի հուսալի տվյալներ ստանալու համար:

 

ապրանքային անուն

Կատու.Ոչ

Չափը

8-Tube PCR շերտեր

0,1 մլ 8-խողովակային PCR շերտեր (կափարիչներով)

PCR00801-EN

125 Շերտեր

0,2 մլ 8-խողովակային PCR շերտեր (կափարիչներով)

PCR00802-EN

125 Շերտեր

96-Ափսե

0.1 մլ կիսաշրջազգեստով 96 հորատանցքով PCR թիթեղներ

PCR09601SS

20/Տուփ

0.2 մլ կիսաշրջազգեստով 96 հորատանցքով PCR թիթեղներ

PCR09602SS

20/Տուփ

Կնքումը Flims

Ճնշման միջոցով ակտիվացված ափսեի կնքման ֆիլմեր

PCR09600PF

100/Տուփ

Ինքնասոսնձվող ափսեի կնքման ֆիլմեր

PCR09600SF

100/Տուփ

           

 

Իմացեք ավելին կամ պատվիրեք առցանց, այցելեք՝ www.vazyme.com