• jou::

Syans nan laboratwa |Ki jan yo anplifye fragman sib nou bezwen yo

An 1983, Ameriken byochimist Kary Mullis te vin ansent lide nan anplifikasyon in vitro nan asid nikleyik, ak an 1985, li te envante pwosesis la ke yo rekonèt kòm reyaksyon chèn polymerase (PCR), bay nesans nan teknik PCR la.An 1988, Saiki et al.konplete avèk siksè anplifikasyon otomatik ADN ak ADN polymerase thermostable izole nanThermus aquaticus, sètadiTaqADN polymerase, fè PCR yon teknoloji biyoloji molekilè pratik ak inivèsèl.

企业微信截图_3549a45d-3d8a-40af-8765-825c514e9320

Sepandan, ak aplikasyon an lajè nan teknoloji PCR konvansyonèl nan divès domèn nan byoloji molekilè, fenomèn tankou ti gwosè echantiyon, echantiyon presye, ak anplifikasyon ki pa espesifik souvan rive.Anplifikasyon ki pa espesifik ka koze pa: Tanperati a pi bon nan konvansyonèl yoTaqADN polymerase se 72 ° C, nan ki aktivite anzim nan pi bon li yo, pandan y ap pi ba a, anzim la se mwens aktif.Anplis de sa, ADN polymerase aktif nan tanperati ki ba, ki mennen nan ekstansyon an nan sekans Jadendanfan inègza ak fòmasyon nan dimers Jadendanfan.Anplifikasyon ki pa espesifik ka rive tou ak anzim wo-fidelite cho-start, ki se sitou ki gen rapò ak kondisyon PCR (Mg2+, tanperati recuit, kantite sik, elatriye).Ki pa espesifik ka lakòzrannman ki ba nan anplikon sib, redwi sansiblite nan anplikon sib, ak efè aplikasyon pòv en.

 

Jodi a, nou pral diskite sou fason pou anplifye fragman sib nou bezwen yo.

01.PCR dirèk

PCR dirèk refere a anplifikasyon ADN sib ki sòti dirèkteman nan yon echantiyon san izolasyon ak pirifikasyon asid nikleyik.

 

Nan etap denaturasyon wo-tanperati a, echantiyon tankou selil oswa tisi yo lysed nan tanpon espesyalman fòmile, ak Lè sa a, ADN la lage.PCR dirèk senplifye workflow ak diminye etap manipilasyon,konsa anpeche pèt ADN nan etap pirifikasyon.Laidantifikasyon PCR koloniadopte nan laboratwa biyoloji molekilè aktyèl reprezante aplikasyon ki pi tipik nan PCR dirèk.PCR ka fèt sou echantiyon dirèk apre tretman senp oswa dilution.

企业微信截图_c3ee340e-ac7a-425d-8da1-e0303a3b5842

02.PCR gradyan

Tou de gradyan PCR ak touchdown PCR optimize tanperati a annealing nan sistèm reyaksyon an, men prensip yo diferan.

 

Gradyan PCR vle di ke lè tanperati a annealing pa trè klè,yo nan lòd yo detèmine tanperati a pi bon recuit, PCR miltip-tib fèt an menm tan sou yon sèl enstriman PCR (yon enstriman PCR ki sipòte fikse tanperati annealing gradyan obligatwa).Chak tib mete sou yon kolòn oswa yon ranje diferan nan enstriman an, epi PCR fèt separeman (egzanp, pou ranje tanperati a nan 50 ~ 60 ° C, mete 6 tib nan 50 ° C, 52 ° C, 54 ° C, 56. °C, 58°C, ak 60°C, respektivman).Finalman, yo detèmine tanperati rkwit ki pi apwopriye a, epi anplifikasyon PCR konvansyonèl yo te pote soti nan tanperati rkwit sa a.

企业微信截图_a73e75f9-5a16-42d2-bd16-d1f385ad5bfc

Li, Lingjuan, et al."DeaLT trase liyaj jenetik selil souch rezidan yo".Pwotokòl lanati.13.10 (2018):2217-2246.

 

 

03.Aterisaj PCR

Anpil konpozan nan sistèm PCR la, tankou primè, modèl, Mg2+, dNTPs, elatriye, ka mennen nan rezilta eksperimantal ki pa kòrèk.Pou modèl konplèks ADN jenomik, PCR konvansyonèl souvan enplike anplifikasyon ki pa espesifik, epi yo pa ka jwenn pwodwi ideyal la vle. Yo nan lòd yo rezoud pwoblèm nan nan anplifikasyon ki pa espesifik nan PCR, Don et al.te envante teknik PCR touchdown (TD-PCR) an 1991.

 

Konpare ak PCR gradyan, PCR touchdown siperyè nan aspè sa yo.Premyèman, reyaksyon miltip oswa reyaksyon miltip tib yo oblije chwazi yon tanperati rkwir ki apwopriye pou PCR gradyan.Dezyèmman, menmsi yo detèmine tanperati pi bon an nan plizyè eksperyans, tanperati pi bon an ka chanje lè yo fè menm anplifikasyon nan ranplase lòt enstriman PCR yo.Nan moman sa a, li nesesè redétèmine tanperati a rkwir optimal.Sepandan, PCR touchdown ka jwenn yon bon efè anplifikasyon ak yon sèl reyaksyon, evite optimize ak detèminasyon tanperati renaturasyon optimal pou chak pè primè.Anplis de sa, PCR touchdown lajman febli restriksyon nan pèfòmans enstriman sou efè a anplifikasyon.

 

Prensip

Tanperati recuit nan PCR a ka afekte rezilta anplifikasyon yo.Kòm tanperati a anplifikasyon ogmante, spesifik anplifikasyon amelyore pandan efikasite anplifikasyon an diminye.Nan kòmansman an nan PCR touchdown, anplifikasyon wo-tanperati fèt pou jwenn pwodwi anplifikasyon espesifik.Apre abondans jèn sib la ogmante, bese tanperati anplifikasyon an ka amelyore efikasite anplifikasyon an.Lè tanperati rkwit la bese nan nivo ki anplifikasyon ki pa espesifik rive, pwodwi anplifikasyon espesifik la gen yon avantaj jeyometrik.Sit ki pa espesifik nan reyaksyon ki rete yo pa ka fè konpetisyon ak sit espesifik akòz abondans ki ba yo, sa ki lakòz yon sèl pwodwi anplifikasyon dominan.

 

Anviwònman tanperati rkwit

Tipikman, ranje tanperati a recuit pou PCR toucher ka jiska 15 ° C, soti nan 5 ° C pi wo pase valè Tm nan alantou 10 ° C anba li.Fè sik 1 - 2 fwa nan chak tanperati, Lè sa a, sik 10 fwa nan tanperati rkwit ki pi ba a.

 

Aplikasyon

Touchdown PCR apwopriye pou eksperyans kote premye yo chanje souvan.San yo pa konnen valè Tm ak san pwoblèm pou detèmine valè Tm pi bon an, PCR touchdown ka byen vit epi espesyalman jwenn fragman anplifye sib la.Anpil enstriman PCR kounye a gen pwogram pou mete PCR touchdown, ki te lajman itilize nan rechèch.

 

Nòt

Malgre ke touchdown PCR gen avantaj, li pa yon Miracles.Touchdown PCR ka sèlman "glase sou gato a";sa vle di si bann prensipal la ka wè, men gen tou bann ki pa espesifik, PCR touchdown ka fèt pou optimize.Men, si gwoup prensipal la pa ka wè pandan y ap sèlman vizib gwoup divès kalite ki pa espesifik, PCR touchdown pa pral travay byen tou.

企业微信截图_c60583f3-79d5-4d96-adf5-28be7cd8be49

04.PCR anbrike

Nich PCR se yon varyasyon PCR sa sèvi ak de(olye ke jis yon sèl) pè primè PCR pou anplifye yon fragman espesifik.Premye pè PCR anplifye fragman menm jan ak PCR konvansyonèl yo.Dezyèm pè a nan premye, relepremye enbrike(tankou yo kouche oswa yo enbrike nan premye fragman an),mare anndan premye anplikon an epi espesyalman anplifye fragman ADN yo entèn nan anplikon inisyal la.

 

Avantaj

Si premye anplifikasyon an pwodui fragman ki pa kòrèk, pwobabilite a se byen ba ke rejyon an ta dwe anplifye nan yon dezyèm tou pa dezyèm pè a nan primè.Kidonk, enbrike PCR gen gwo spesifik anplifikasyon.

 

Pwosesis eksperyans

Etap 1: Premye pè primè yo montre an vèt mare ak modèl sib ADN la.Akòz espesifik ensifizan, li ka mare tou nan lòt fragman ak sit obligatwa ki sanble ak anplifye sib.

Etap 2: Sèvi ak dezyèm pè a nan primè zoranj yo mare nan fragman an sib anplifye nan premye etap la, ak Lè sa a, fè dezyèm tou nan anplifikasyon.Kòm primè sa yo enbrike nan premye pwodwi PCR la,tHey fè li trè fasil ke pwodwi PCR ki pa espesyalman anplifye ta gen sit obligatwa pou tou de pè primè..Kidonk, dezyèm seri primè a pa ka anplifye fragman ki pa sib.Anplifikasyon anplifikasyon PCR sa a asire ke pwodwi PCR ki soti nan dezyèm tou an nan anplifikasyon PCR gen ti kras oswa pa gen okenn kontaminasyon soti nan pwodwi PCR ki pa espesifikman anplifye ki soti nan sekans sib altènatif Jadendanfan.