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2 × Phanta Max Master Mix (Dye Plus) P525

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Description du produit

Phanta Max a ajouté des facteurs d'élongation uniques, des facteurs favorisant la spécificité et des facteurs de désinhibition du plateau, ce qui améliore considérablement la capacité d'amplification de fragments longs, la spécificité d'amplification et le rendement d'amplification.En utilisant des modèles simples tels que λDNA et des plasmides, Phanta Max peut amplifier efficacement des fragments jusqu'à 40 kb ;en utilisant des modèles complexes tels que l'ADN génomique, Phanta Max peut amplifier efficacement des fragments jusqu'à 20 kb ;en utilisant des modèles d'ADNc, Phanta Max Il peut amplifier efficacement des fragments jusqu'à 10 Ko.Son taux d'erreur d'amplification est de 1/128 de celui de la polymérase Taq conventionnelle et de 1/6 de celui de la polymérase Pfu.De plus, Phanta Max présente une bonne résistance aux inhibiteurs de la PCR et peut être utilisé pour la PCR directe de bactéries, de champignons, de tissus végétaux, de tissus animaux ou d'échantillons de sang total.Phanta Max contient deux anticorps monoclonaux qui peuvent inhiber son activité polymérase 5' → 3' et son activité exonucléase 3' → 5' à température ambiante, permettant une PCR à démarrage à chaud hautement spécifique.Ce produit contient de l'ADN polymérase Phanta Max Super-Fidelity, du dNTP et un système tampon optimisé.Il suffit d’ajouter des amorces et des modèles pour effectuer l’amplification, ce qui réduit les opérations de pipetage et améliore le débit de détection et la reproductibilité des résultats.L'agent protecteur ajouté au système permet au 2 × Master mix de maintenir une activité stable après des congélations et décongélations répétées.Le kit contient un colorant de charge, qui peut être directement repéré pour l'électrophorèse après réaction.L'enzyme a une activité 5'→ 3'polymérase et une activité 3'→ 5'exonucléase, et le produit amplifié est à extrémités franches, adapté aux kits de clonage ClonExpress et TOPO (C112/C113/C115/C601).

caractéristiques du produit

Super fidélité :La fidélité est 128 fois supérieure à celle de la Taq ADN polymérase ;
Amplification plus rapide :La vitesse limite peut atteindre 0,5 sec/ko, 30 sec/ko peuvent amplifier efficacement la plupart des fragments ;
Amplification plus longue :La longueur d'amplification efficace de modèles simples tels que le plasmide et l'ADN λ peut atteindre 40 kb, la longueur d'amplification efficace de l'ADNc peut atteindre 10 kb et la longueur d'amplification efficace du génome peut atteindre 20 kb ;
Grande adaptabilité :Il convient à l'amplification de divers fragments contenus en GC, présente une super tolérance aux inhibiteurs de PCR et peut être utilisé pour la PCR directe d'une variété d'échantillons.

Citation

Li, Yufeng et coll."DRAK2 aggrave la progression de la stéatose hépatique non alcoolique grâce à l'épissage alternatif de l'ARN associé à SRSF6."Métabolisme cellulaire 33.10 (2021) : 2004-2020.

Gu, Haiyan et coll."PCBP2 maintient l'homéostasie de la signalisation antivirale en régulant l'activité enzymatique du cGAS en antagonisant sa condensation."Communication sur la nature 13.1 (2022) : 1-16.

Chen, Weizhong et coll."Criblage génétique ciblé chez les bactéries avec une transposase guidée par Cas12k."Rapports cellulaires 36.9 (2021) : 109635.

Chen, Lili et coll." Pilotage d'évasion par la signalisation peptidergique de la cholécystokinine. "Rapports cellulaires 38.6 (2022) : 110330.

FAQ

Q1 : L'efficacité de l'amplification est faible et il n'y a pas de bandes amplifiées dans le groupe de test.

A1 : (1) Amorces

Vérifiez si les apprêts synthétiques se sont dégradés en raison d'un stockage inapproprié ;examiner la conception des amorces et utiliser BLAST pour examiner la spécificité des amorces ou reconcevoir les amorces.

(2) Modèle

Un stockage à long terme ou des cycles répétés de congélation-dégel entraîneront une rupture, une entaille ou une dégradation de l'ADN. La matrice doit donc être l'ADN double brin fraîchement préparé.Une teneur trop élevée en GC dans la matrice rendra difficile la séparation des doubles brins d'ADN ;dans ce cas, ajoutez PCR Enhancer (Cat. No. P021) pour abaisser efficacement la température de fusion.Les échantillons bruts peuvent contenir des inhibiteurs, il est donc recommandé de réduire la concentration du modèle (à utiliser après dilution ; si une feuille de plante est utilisée, assurez-vous que la plante n'est pas riche en polysaccharides ou polyphénols, prenez une jeune feuille fraîche et coupez-la. de la taille de l'extrémité d'une pointe de pipette jaune).Si de l'ADNc est utilisé, vérifiez la pureté et l'intégrité de l'ARN utilisé pour la transcription inverse.

(3) Enzymes

L'enzyme utilisée dans la réaction a été inactivée.Répétez l'expérience avec une nouvelle enzyme ou une enzyme provenant d'une autre source.

(4) Système d'amplification

Le système réactionnel a été mal préparé.Répétez l'expérience avec le bon système.

(5) Programme de réaction

Vérifiez si la température de dénaturation est correcte et si la température affichée sur le système PCR est la même que la température réelle.Si la température est trop élevée, l’enzyme sera rapidement inactivée dès les premiers cycles.Si la température est trop basse, le gabarit ne sera pas complètement dénaturé.Si de la levure est utilisée comme modèle, le temps de pré-dénaturation peut être prolongé jusqu'à 10 minutes.Si la température de recuit est inappropriée, déterminez la température de recuit appropriée en testant un gradient de températures de recuit.Si le fragment cible est long, essayez le programme Touchdown PCR.Vérifiez si le délai de prolongation est suffisant.

 

Q2 : Les bandes amplifiées sont faibles.

A2 : (1) Amorces

Vérifiez si les amorces synthétiques se sont dégradées.

(2) Modèle

Vérifiez la qualité du modèle.Un stockage à long terme ou des cycles répétés de congélation-dégel entraîneront une rupture, une entaille ou une dégradation de l'ADN. L'ADN double brin fraîchement préparé doit donc être utilisé comme matrice.Si le modèle a été épuisé, utilisez des dilutions en série du produit d’amplification initial comme modèles pour l’amplification ultérieure.

(3) Programme de réaction

Essayez le programme PCR de touché ;augmenter le temps de prolongation et le nombre de cycles.

 

Q3 : la spécificité de l'amplification est faible ou il existe des produits non spécifiques.

A3 : (1) Amorces

La conception de l’amorce n’est pas optimale.Si les amorces se sont liées à des sites non spécifiques de la séquence cible ou les unes aux autres pour former des dimères, optimisez en réduisant la concentration d’amorces ou en reconcevant les amorces si nécessaire.

(2) Modèle

Si le modèle est impur ou contaminé, préparez un nouveau modèle.

Si le modèle s'est dégradé ou si une trop grande quantité de modèle a été utilisée, examiner l'intégrité et la concentration du modèle par électrophorèse et purifier à nouveau le modèle si nécessaire.Consultez le mode d’emploi pour connaître la quantité saisie dans le modèle.

(3) Programme de réaction

Le programme de réaction n'est pas optimal.S'il existe des bandes diverses non spécifiques plus petites que la bande cible, augmentez la température de recuit et réduisez le nombre de cycles.S'il existe des bandes diverses non spécifiques plus grandes que la bande cible, réduisez le temps d'extension et le nombre de cycles.

 

Q4 : Les bandes sont diffuses ou étalées lorsque les produits d'amplification sont appliqués sur un gel.

A4 : (1) Gel

Faire fondre complètement le gel pendant la préparation.

(2) Apprêts

Vérifiez si les amorces se sont dégradées.

(3) Modèle

Le modèle est dégradé ou excessif.Examiner l’intégrité et la concentration du modèle par électrophorèse et préparer un nouveau modèle si nécessaire.Consultez le mode d’emploi pour connaître la quantité saisie dans le modèle.Si la bande cible est longue et que l’ADNc est utilisé comme modèle, vérifiez la pureté et l’intégrité de l’ARN utilisé pour la transcription inverse et effectuez à nouveau la transcription inverse sans amorces aléatoires.

(4) Programme de réaction

Le programme de réaction n'est pas optimal.Si la température de recuit est inappropriée, déterminez la température de recuit appropriée en testant un gradient de températures de recuit.Essayez le programme PCR de touché.

 

Q5 : Il existe des produits d’amplification dans le groupe de contrôle à blanc (NTC).

A5 : (1) Conception problématique de l’amorce

La séquence amplifiée est homologue à la séquence non cible.Ainsi, les séquences non cibles sont également amplifiées en PCR.

(2) Si la bande correspondant au produit d'amplification a la même taille que les bandes cibles, cela indique une contamination.

Répétez l'expérience avec un mélange frais, de l'eau ou des apprêts.Préparez le système de réaction sur un établi ultra-propre pour minimiser la contamination par les aérosols.

(3) Pour éviter la contamination croisée de la séquence cible par le génome ou de gros fragments, effectuez les étapes avec précaution afin d'éviter que la séquence cible ne soit pipetée dans la pipette de chargement ou ne s'échappe des tubes à centrifuger.

(4) Pour éviter la contamination du gène cible par de petits fragments d'acide nucléique en suspension dans l'air, utilisez la méthode PCR imbriquée pour réduire ou éliminer la contamination.

 

Q6 : La polymérase haute fidélité a une mauvaise fidélité et introduit des mutations.

A6 : Les mutations dans la PCR haute fidélité peuvent être analysées sous les aspects suivants :

(1) Il y a des mutations dans le modèle.

Vérifiez si le modèle est muté.S'il s'agit d'un plasmide, soumettez-le au séquençage.S'il s'agit d'ADNc, répétez le test ;si la mutation est toujours présente, il peut y avoir des problèmes avec l'ADNc.Dans ce cas, il est recommandé de préparer de nouveaux ADNc après avoir vérifié l’intégrité et la pureté de l’ARN.

(2) La mutation peut résulter d'une exposition prolongée du modèle à la lumière UV.

Évitez l’exposition prolongée aux UV pendant l’extraction du gel.

(3) La séquence du gène n'est pas cohérente avec la séquence NCBI.

Soumettez à nouveau l’ADN pour le séquençage.Si le résultat reste le même, cela signifie que la séquence peut être incompatible avec celle répertoriée sur NCBI.

(4) Des séquences recombinantes similaires conduisent à une mauvaise recombinaison.

 

Q7 : Combien de modèles doivent être saisis si l’ADNc du produit de transcription inverse est utilisé comme modèle pour la PCR haute fidélité ?

A7 : La quantité d'entrée du modèle d'ADNc recommandée dans le mode d'emploi est de 1 à 5 μl (pas plus de 1/10 du volume total du système PCR).Déterminez la quantité d’entrée appropriée en testant différentes quantités de modèles dans cette plage.

 

Q8 : Les produits PCR colorés affectent-ils la digestion par restriction ?

A8 : Les tests montrent que les produits PCR colorés n’affectent pas la digestion par restriction.

 

Q9 : Les produits d'amplification obtenus avec des polymérases haute fidélité ont-ils des queues poly(A) ?Comment ajouter des queues poly(A) ?

A9 : (1) Les produits d’amplification obtenus avec des polymérases haute fidélité n’ont pas de queues poly(A).Pour un clonage ultérieur, essayez le produit de clonage transparent C601 de Vazyme ;pour le clonage TA, ajoutez une queue poly(A) en utilisant une polymérase Taq universelle :

Méthode de queue Poly(A) : système de 10 µl avec la polymérase Taq uniquement :

1 μl de tampon 10 × Taq (contenant du MgCl2)

0,5 μl de dNTP 10 mM

0,2 μl d'ADN polymérase Taq (ne contenant aucune amorce)

1 à 7 μl de fragments PCR purifiés

Ajouter un ddH2O à 10 µl

Système de mélange Taq :

2 × Taq Master Mix 5 µl

Fragments PCR purifiés 1 – 7 μl

ddH2O 10 µl

Conditions de réaction : 72°C 10 min.

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