• ден::

Наука в лаборатория |Нещо, което трябва да знаете за АДАПТЕРИТЕ

 

Адаптерите са съществена част от подготовката на библиотеката.Подобно на NGS технологиите, те непрекъснато се развиват.Чувствате се затрупани от умопомрачителното разнообразие от адаптери, налични на пазара?не се тревожи!Нека разгледаме всичко, което трябва да знаете за адаптерите.

 

Адаптерите са нуклеотидни последователности, добавени към двата края на ДНК фрагменти по време на подготовката на библиотеката, за да се осигури съвместимост със секвенсора.Фигурата по-долу показва пълна библиотека с двойно индексиране, като адаптерите са отбелязани в сините полета.

图片1

Фигура 1. Структура на библиотеката (източник: Illumina).

 

Адаптерите могат да бъдат разделени на няколко категории:

 

По позиция на индекса: адаптери с един индекс срещу адаптери с двоен индекс

Единично индексирани адаптери: съдържат индексни последователности в края на P7;

图片2

Фигура 2. Схема на адаптер с единичен индекс

 

Двойно индексирани адаптери: съдържат индексни последователности в краищата на P5 и P7;

图片3

Фигура 3. Схема на адаптер с двоен индекс

 

Типичните индексни последователности са с дължина 6 nt или 8 nt.За 8-nt индекси на теория има 48единичен индекс и 416комбинации с двоен индекс.Като се има предвид необходимостта от поддържане на основния и цветовия баланс на комбинациите от индекси по време на последователността, броят на наличните избори на индекси всъщност е доста ограничен.Въпреки това има много повече адаптери с двоен индекс, отколкото с единичен индекс.Виеможете да избирате между тях въз основа на размера на вашата извадка.

 

Чрез съвместимост с подготовка на библиотека без PCR: пълни срещу частични адаптери

图片4

Фигура 4. Методи за усилване за пълни срещу частични адаптери

 

Пълни адаптеримогат да бъдат добавени към краищата на ДНК фрагменти чрез ТА лигиране.При достатъчни добиви на библиотеката, тези библиотеки могат да се използват директно за секвениране без PCR амплификация (без PCR).

 

След TA лигиране начастични адаптеридо краищата на ДНК фрагменти, тези частични адаптери трябва да бъдат разширени в адаптери с пълна дължина чрез PCR, като се използват индексиращи праймери, допълващи късите адапторни последователности, преди библиотеките да са готови за секвениране. Когато се използват частични адаптери, амплификацията на библиотеката трябва да се извърши с помощта на праймери, съдържащи индексни последователности (предоставени в комплекта адаптери), вместо универсални праймери, които не съдържат индексни секвенцииences.

 

UDI & UMI

За да се смекчи прескачането на индекса, което е по-забележимо при шаблонни поточни клетки (HiSeq и NovaSeq), Illumina препоръчва подготовката на двойно индексирани библиотеки с уникални индекси.Чрез маркиране както на P5, така и на P7 завършва с уникални идентификатори или уникални двойни индекси (UDI), тази стратегия присвоява напълно уникални, неповтарящи се индекси P5 и P7 на всяка двойка, позволявайки кръстосана проверка на двата индекса и ефективно намалявайки неправилното присвояване на индекси.

5

Фигура 5. UDI разрешава прескачане на индекса и неправилно присвояване (Източник: Burning Rock)

 

Уникални молекулярни идентификатори (UMI) се използват за идентифициране на нискочестотни варианти в cfDNA, като същевременно се избягват фалшиви положителни резултати.Чрез маркиране на оригиналните ДНК фрагменти, последователността на резултатите от секвенирането може да бъде проверена в копия на една и съща оригинална ДНК последователност, елиминирайки фалшивите положителни резултати и подобрявайки извикването на нискочестотен вариант.

6

Фигура 6. UMI улеснява откриването на нискочестотни варианти

 

Както е показано на Фигура 6-(1), някои базови мутации се въвеждат по време на подготовката на библиотеката или секвенирането (обозначени в червено), които се появяват като фалшиви положителни резултати.Корекцията на UMI премахва тези две фалшиви положителни повиквания.На Фигура 6-(2), съжителстват истински нискочестотни мутации (най-дясно T) и фалшиви положителни резултати (основи в червено).Корекцията на UMI запазва истинската мутация (най-десния T), като същевременно премахва фалшивите положителни резултати (основи в червено), като по този начин подобрява точността на откриването на нискочестотна мутация.На Фигура 6-(3), която не включва UMI, истинските мутации (най-десният T) и фалшивите положителни резултати (бази в червено) не могат да бъдат разграничени.Много потенциални последователности са идентифицирани, но те не отразяват истинските характеристики на пробата.