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Taq DNA Polymerase (Mg2+ free Buffer)

TaqDNAPolymerase(Mg2+freeBuffer)  高纯度耐热DNA聚合酶 优化的缓冲体系,便于快速得到理想的扩增结果;提供即用型的预混液,最大程度地减少实验步骤   本产品由克隆有ThermusaquaticusDNAPolymerase基因的大肠杆菌表达并经过多步纯化精制得到,不含核酸内切酶、核酸外切酶以及细菌DNA。TaqDNAPolymerase具有5’→3’聚合酶活性和5
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P102-01/02/03
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Taq DNA Polymerase (Mg2+ free Buffer)

高纯度耐热DNA聚合酶

优化的缓冲体系,便于快速得到理想的扩增结果

本产品由克隆有Thermus aquaticus DNA Polymerase 基因的大肠杆菌表达并经过多步纯化精制得到,不含核酸内切酶、核酸外切酶以及细菌DNATaq DNA Polymerase 具有5’ → 3’ 聚合酶活性和5’ → 3’ 外切酶活性,但无3’ → 5’ 外切酶活性。PCR 产物的3’ 端带A,可克隆至T 载体,并适用于ClonExpress® 快速克隆试剂盒(C112/C113/ C115/C601)

组分 P102-01 1,000 U P102-02 5,000 U P102-03 10,000 U
10×Taq Buffer (Mg2+ free) 4 ml P102-01× 5 P102-01× 10
25 mM MgCl2 4 ml
Taq DNA Polymerase (5 U/μl) 200 µl

-20℃保存。

Keyword:
P102-0
高纯度耐热DNA聚合酶
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Q1:扩增效率低,实验组无扩增条带。

A1:(1) 引物

检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解;引物设计是否合理,可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

(2) 模板

长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的DNA双链作为模板;模板GC含量过高会导致DNA的双链无法打开,此时加入PCR Enhancer(货号P021),可以有效降低解链温度;模板的GC含量过低会导致扩增效率较差,可适当延长引物长度或通过梯度PCR摸索合适的反应条件;模板中存在抑制物,特别是甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,会造成DNA脱嘌呤而影响PCR结果,建议稀释使用或重新制备;若模板为cDNA,要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度。

(3) 酶

反应所用的酶因保存或运输不当而失活,建议更换新酶或用另一来源的酶重新实验。

(4) 扩增体系

反应体系配制错误,建议重复实验。

(5) 反应程序

检查变性温度是否准确,PCR仪指示温度与实际温度是否相符。如果温度过高,酶在前几个循环就迅速失活;温度过低则模板变性不彻底。可对退火温度设置梯度,摸索最佳的退火温度。检测延伸时间是否充足。

(6) Mg2+浓度不合适

Mg2+浓度过低可影响PCR产量甚至使PCR扩增失败;Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性,应适当调整Mg2+浓度。

Q2:扩增的条带亮度不太亮。

A2:(1) 引物

检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解。

(2) 模板

首先确认模板的质量,长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的DNA双链作为模板;如果模板没有了,可用首次扩增产物按倍比稀释后作为模板进行二次扩增。

(3) 酶

可适当提高酶的使用量。

(4) 反应程序

可尝试使用Touch Down程序;延长延伸时间,提高循环数。

Q3:扩增特异性差,非特异性扩增。

A3:(1) 引物

引物设计不够优化。引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体,可降低引物浓度进行优化,必要时重新设计引物。

(2) 模板

模板不纯,被污染,需重新制备模板。

模板降解或过量,通过电泳检查模板完整性及浓度,必要时重新纯化模板。模板的使用量请参考说明书。

(3) 反应程序

反应程序不够优化。如果出现比目的条带小的杂带,可通过提高退火温度,降低循环数调整;如果出现比目的条带大的杂带,可缩短延伸时间、降低循环数。

(4) 酶

酶量加入过多。Taq系列:50µl体系加2U。

Q4:空白对照出现扩增产物。

A4:(1) 引物设计不合理

扩增序列与非目的扩增序列有同源性,PCR也可以扩增出非靶序列的序列。

(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致,说明有污染

更换新的Mix、水或引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。

(3) 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

(4) 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸污染,可用巢式PCR方法减轻或消除污染。

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